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interactome:experiments:20191122-2 [2019/11/22 17:45]
dan [Table]
interactome:experiments:20191122-2 [2019/11/22 17:58] (current)
dan
Line 1: Line 1:
 ## RNA extraction from HEK293T cells ## RNA extraction from HEK293T cells
-{{tag>protocol RNA kit interactome PersonalInteractome}}+{{tag>​interactome PersonalInteractome}}
  
 #### Material #### Material
Line 23: Line 23:
   * Freshly prepared DNaseI solution included in the kit   * Freshly prepared DNaseI solution included in the kit
  
-^  Check  ^  Reagent ​            ​^ ​  ​^ ​ 1 reaction (µL)  ^  ​_ _ _ _ reaction (µL)  ^ Memo                                              +^  Check  ^  Reagent ​            ​^ ​  ​^ ​ 1 reaction (µL)  ^  ​reaction (µL)  ^ Memo                   ​
-|         ​| ​ ddH2O (RNAse free)  |   ​| ​                  ​                        ​                                                  ​+|         ​| ​ ddH2O (RNAse free)  |   ​| ​ ​87.5 ​             ​175 ​             ​                       
-|         | 10x DNase Buffer ​    ​| ​  ​| ​ 10               ​| ​                        ​                                                  ​+|         | 10x DNase Buffer ​    ​| ​  ​| ​ 10               ​| ​ ​20 ​                                     
-|         ​| ​ DNaseI ​             |   ​|  ​30 units                                 ​                                                  ​+|         ​| ​ DNaseI ​             |   ​|  ​2.5              ​ ​5 ​               ​30 units. 12 units/​µL  ​
-^         ​^ ​ Total volume (µL)   ​^ ​  ​^ ​ 100              ​^                         ^  ​_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  ​^+^         ​^ ​ Total volume (µL)   ​^ ​  ​^ ​ 100              ^  ​200              ^                        ​^
  
 \\ \\
Line 151: Line 151:
  
 ## 1st strand cDNA synthesis of RNA samples extracted on 20191122 ## 1st strand cDNA synthesis of RNA samples extracted on 20191122
-{{tag>​protocol RNA cDNA kit interactome PersonalInteractome}} 
  
 #### Material #### Material
Line 180: Line 179:
  
  
-^ Reagent ​                  ^ Volume for 1 reaction (µL)  ​Volume for reactions (µL)  ^ Note                               ^ +^ Reagent ​                  ​^ ​ Volume for 1 reaction (µL)  ​^  ​Volume for 10 reactions (µL)  ^ Note                               ^ 
-| Oligo dT Primer(50 μM) ​   | 1                           ​| ​                           ​| ​                                   | +| Oligo dT Primer(50 μM) ​   |  1                           ​| ​ ​10 ​                           ​| ​                                   | 
-| dNTP Mixture(10 mM each) ​ | 1                           ​| ​                           ​| ​                                   | +| dNTP Mixture(10 mM each) ​ |  1                           ​| ​ ​10 ​                           ​| ​                                   | 
-| RNA Template ​             | ~8                          | 25                           | Total RNA:<5 μg, polyA+ RNA:<1 μg  | +| RNA Template ​             |  ~8                          |  ​50 ​                           ​| Total RNA:<5 μg, polyA+ RNA:<1 μg  | 
-| RNase Free dH2O           | up to 10                    | 15                           |                                    | +| RNase Free dH2O           ​| ​ up to 10                    |  ​30 ​                           ​|                                    | 
-Total                     10                          ​| 50                           |                                    | +Total                     ^  ​10                          ​^  100                           |                                    |
  
 +  *Aliquot to 10 x 10 µL
   *Incubate at 65˚C for 5 mins   *Incubate at 65˚C for 5 mins
   *Transfer tube to ice immediately ​   *Transfer tube to ice immediately ​
Line 197: Line 196:
 ==2  Reverse transcription == ==2  Reverse transcription ==
  
-  *Add the following reaction ​mix, and make the total volume 20 µL.+  *Prepare master ​mix for reaction;
  
 +^ Reagent ​                        ^ Volume per 1 reaction (µL)  ^ Volume per 5 reaction (µL)  ^ Note               ^
 +| 5×PrimeScript II Buffer ​        | 4                           | 20                          |                    |
 +| RNase Inhibitor(40 U/​μl) ​       | 0.5                         | 2                           | 20U per reaction ​  |
 +| PrimeScript II RTase(200 U/​μl) ​ | 1                           | 5                           | 200U per reaction ​ |
 +^ RNase Free dH2O                 ^ 4.5                         | 22.5                        ^                    ^
  
-^ Reagent ​                         ^ Volume ​       ^ Note  ^ 
-| Reaction mix from previous step  | 10 μL         ​| ​      | 
-| 5×PrimeScript II Buffer ​         | 4 μL          |       | 
-| RNase Inhibitor(40 U/​μl) ​        | 0.5 μL(20 U)  |       | 
-| PrimeScript II RTase(200 U/​μl) ​  | 1 μL(200 U)   ​| ​      | 
-^ RNase Free dH2O                  ^ up to 20 μL   ​^ ​      ^ 
  
 +  *Add 10 µL of the master mix to each tube to make the total volume 20 µL.
  
   *Mix gently   *Mix gently
Line 213: Line 212:
  
 ^ Temprature ​ ^ Time       ^ Note                                                                                                  ^ ^ Temprature ​ ^ Time       ^ Note                                                                                                  ^
-| 30˚C        | 10 min     | Only when using random 6mer primers ​                                                                  | +| 45˚C        | 60 min  |                                                                               ​|
-| 45˚C        | 30-60 min  |                                                                                                       ​|+
 | 75˚C        | 15 min      | Deactivation. Paramater for long transcrpits just in case.  | | 75˚C        | 15 min      | Deactivation. Paramater for long transcrpits just in case.  |
 | 4˚C         | Forever ​   | (Immediately put on ice.)                                                                             | | 4˚C         | Forever ​   | (Immediately put on ice.)                                                                             |
Line 222: Line 220:
   *The cDNA product should be stored at -20°C. ​   *The cDNA product should be stored at -20°C. ​
   *For downsteam PCR amplification,​ the volume of cDNA product should not exceed 1/10 of the PCR reaction volume.   *For downsteam PCR amplification,​ the volume of cDNA product should not exceed 1/10 of the PCR reaction volume.
 +
 +
 +^  Sample No.  ^  Date prepared ​ ^  Number of freeze ​ ^  Number of thaw  ^  "​Done"​ if used  ^
 +|  1           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  2           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  3           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  4           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  5           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  6           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  7           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  8           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  9           ​| ​ 20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 +|  10          |  20191122 ​      ​| ​ 1                 ​| ​ 0               ​| ​                 |
 \\ \\
 \\  \\
Line 229: Line 240:
 \\  \\
 ==Protocol last updated== ==Protocol last updated==
- --- //​[[daney@sfc.keio.ac.jp|Dan Yamamoto-Evans]] 2019/11/21 15:16// + --- //​[[daney@sfc.keio.ac.jp|Dan Yamamoto-Evans]] 2019/11/22 17:55//
-\\ +
-\\  +
-==Protocol used==+
  • interactome/experiments/20191122-2.1574412310.txt.gz
  • Last modified: 2019/11/22 17:45
  • by dan