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interactome:experiments:20191129 [2019/11/29 10:51]
dan created
interactome:experiments:20191129 [2019/11/29 12:48]
dan
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 ## POEM project | N-term DHFR-PCA plasmid construction ## POEM project | N-term DHFR-PCA plasmid construction
-## T4 ligation ​ 
- 
 {{tag>​protocol POEM N-termDHFR interactome}} {{tag>​protocol POEM N-termDHFR interactome}}
  
-== Performing step2 of two-step ligation to generate pDEST-DHFR F[1,2] (Nterm). ==+## Back bone/ insert preparation for generating pDN0511
  
 #### Material #### Material
  
 +^ Check  ^ Reagent ​               ^ Supplier ​        ^ Cat. no    | Primer/​Sample ID  ^ Memo                     ^
 +|        | Purified PCR product ​  ​| ​                 |            | POEM5 & POEM6     ​| ​                         |
 +|        | ddH2O                  | Invurtogen ​      | 10977-015 ​ |                   ​| ​                         |
 +|        | I-CeuI ​            | NEB              |      |                   | 37C, Inactivated at 80C  |
 +|        | I-SceI ​               | NEB              |      |                   | 37C, Inactivated at 65C  |
 +|        | 10x Cutsmart buffer ​   | NEB              | B7204      |                   ​| ​                         |
 +|        | FasGene PCR clean kit  | Nippon Genetics ​ | FG-91302 ​  ​| ​                  ​| ​                         |
  
-  *Set up the following reaction in a microcentrifuge tube on ice.(T4 DNA Ligase should be added last. ) 
-  *Note that the table shows a ligation using a molar ratio of 1:3 vector to insert for the indicated DNA sizes.) ​ 
-  *Use NEBioCalculator to calculate molar ratios. ​ 
  
 +\\
 +\\
 +\\
 +\\
 +\\
 +\\
 +\\
 +#### Protocol
  
-^ Check  ^ Reagent ​              ^ Volume ​   ^ Memo        ^ +==1  Reaction preparation==
-|        | ddH2O                 | Up to 10  |             | +
-|        | Backbone fragment ​    | X         | 0.030 pmol  | +
-|        | Insert fragment ​      | Y         | 0.120 pmol  | +
-|        | 10x T4 ligase Buffer ​ | 1         ​| ​            | +
-|        | T4 ligase ​            | 1         ​| ​            | +
-|        | Total volume (µL)     | 10        |             |+
  
 +  *Mix the following reagents in one tube (ideally from top to bottom)
  
-Reaction+^  Check  ^  Reagent ​      ​^ ​ Volume (µl)   per reaction ​ ^  Final concenration ​     |^ Memo                   ^ 
 +|         | 10x CS buffer ​ |  3                           ​| ​                   1 | x  |                        | 
 +|         | DNA            |  21                          |                      |    | For gel extraction ​ | 
 +|         | I-CeuI ​       |   ​3 ​                         |                      |    |                  | 
 +|         | I-SceI ​     |  3                           ​| ​                     |    |                  | 
 +|         ^ Total (µL)     ​^ ​ 30                          |                      |    |                        | 
 +\\ 
 +\\ 
 +==2 Reaction==
  
-^ Fragment ​                   ^  Size (bp)  ^  Conc. (ng/​µL) ​ ^  Desired Mol  ^  Desired mass (ng)  ^  Desired Vol (µL)  ^ +  *Run the following program on a thermal cycler ​
-| pDN0501 frag1               ​| ​ 9772       ​| ​ 20             ​| ​ 15 fmol      |  90                 ​| ​ 4.5               | +
-| Inser fragment (POEM13 I-CeuI/​I-SceI) ​ |  499        |  30           ​| ​ 120 fmol     ​| ​ 31                 ​| ​ 1               | +
-| ddH2O                       ​| ​ -          |  -              |  -            |  -                  |  2.5                 |+
  
 +^ STEP  ^ Action ​ ^ Time      ^ Memo            ^
 +| 1     | 37˚C    | 1 hour  | Reaction ​       |
 +| 2     | 80˚C    | 20 mins   | Inativation ​    |
 +| 7     | 4˚C     | FOREVER ​  | Stop reaction. ​ |
  
- 
- 
- 
-  *The T4 DNA Ligase Buffer should be thawed and resuspended at room temperature. 
-  *Gently mix the reaction by pipetting up and down and microfuge briefly. 
-  *For cohesive (sticky) ends, incubate at 16°C overnight or room temperature for 10 minutes. 
-  *For blunt ends or single base overhangs, incubate at 16°C overnight or room temperature for 2 hours (alternatively,​ high concentration T4 DNA Ligase can be used in a 10 minute ligation). 
-  *Heat inactivate at 65°C for 10 minutes. 
-  *Chill on ice and transform 1-5 μl of the reaction into 50 μl of ccdB survival competent cells. 
-  *Plate on LB+amp plates 
- 
- 
- 
-\\ 
 \\  \\
 \\ \\
-\\  +== Run gel and extract band.==
-Based on NEB protocol for T4 ligation. +
-https://​international.neb.com/​protocols/​0001/​01/​01/​dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202+
  
- --- //​[[daney@sfc.keio.ac.jp|Dan Yamamoto-Evans]] 2019/11/24 14:25// +\\ 
- +\\ 
-Print at 96%.+ --- //​[[daney@sfc.keio.ac.jp|Dan Yamamoto-Evans]] 2019/11/29 12:33// 
 +**Print at 96%**
  • interactome/experiments/20191129.txt
  • Last modified: 2019/11/29 12:51
  • by dan