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 == Barcoded cDNA generation with fusion PCR. == == Barcoded cDNA generation with fusion PCR. ==
- 
-#### Material 
-\\ 
 #### Protocol #### Protocol
  
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 List of paramater tested. List of paramater tested.
  
-|  RT                   |  -        ​|  +        ​|  -       |  +       ​| ​ ​- ​      |  ​+       ​| ​ -      ​ ​+ ​     |  -         ​| ​ +         +|  RT                   ​| ​ +        |  +       ​| ​  ​Memo  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _                                                           ​
-^ Tm/Target gene        ​^  MORF4L1  ​^  MORF4L1 ​ ^  MRFAP1  ​^  MRFAP1 ​ ^  BCL2L2 ​ ^  BCL2L2 ​ ^  BIK    ^  BIK    ^  MRFAP1L1 ​ ^  MRFAP1L1 ​ ^ +^ Tm/Target gene        ^  MORF4L1 ​ ^  MRFAP1  ​|   | |   | 
-^  Row/Col on PCR plate ^  1        ^  2        ​^ ​ 3       ​^  4       ​^ ​ 5       ​^ ​ 6       ​^ ​ 7      ^  8      ^  9         ​^ ​ 10        ^ +^  Row/Col on PCR plate ^  1        ^  2       |   ​| ​                                                             |   | 
-^  Frd primer ​          |  PI 11    ​|  PI 11    |  PI 13   ​| ​ PI 13   |  PI 15   |  ​PI 15   |  ​PI 17  ​|  ​PI 17  ​|  ​PI 19     |  ​PI 19     +^  Frd primer ​          ​| ​ PI 11    |  PI 13   |   ​| ​                                                             |   | 
- Rvs Primer ​          |  ​PI 12    ​|  ​PI 12    ​| ​ PI 14   |  PI 14   |  ​PI 16   |  ​PI 16   |  ​PI 18  ​|  ​PI 18  ​|  ​PI 20     ​|  ​PI 20     ​+^  Rvs Primer ​          |  PI 2     |  PI 2    |   ​|                                                              |   | 
-|  ​Tm                   |  ​56       |  ​56        ​58 ​     ​|  ​58      ​|  ​65      ​|  ​65      ​|  ​56     |  ​56     |  ​57        ​ ​57 ​       ​|+|                       ​| ​          ​| ​         |   ​| ​                                                             |   | 
 +|  ​Row/​Template ​        ​| ​          ​| ​         |   ​|                                                              |   | 
 +|  ​A                    |  7-20     |  ​5-20    |   ​| ​                                                             |   | 
 + B                    ​|  ​7-30     |  ​5-30    |   ​| ​                                                             |   
 + C                    ​|  ​7-40     |  ​5-40    ​| ​  ​| ​                                                             ​| ​  ​
 +|  ​D                    ​|  ​7-50     |  ​5-50    |   ​| ​                                                             |   | 
 +|  ​E                    ​|  ​8-20     ​|  ​6-20    ​| ​  ​| ​                                                             |   
 +|  ​F                    ​|  ​8-30     |  ​6-30    ​  |                                                              |   | 
 +|  ​G                    ​|  ​8-40     |  ​6-40    |   ​| ​                                                             |   | 
 +|  ​H                    ​|  ​8-50     |  ​6-50    ​  |                                                              |   |
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- 
   *Mix the following reagents in one tube (ideally from top to bottom)   *Mix the following reagents in one tube (ideally from top to bottom)
  
 ^  Check                    ^  Reagent ​               ^  Volume (µl)   1 reaction ​ ^  Volume (µl) for 25 reactions with 20µL vol  ^  Final concenration ​      |^ Memo                                                            ^ ^  Check                    ^  Reagent ​               ^  Volume (µl)   1 reaction ​ ^  Volume (µl) for 25 reactions with 20µL vol  ^  Final concenration ​      |^ Memo                                                            ^
-|                           | ddH20                   ​| ​ 6.62                      ​|  ​331                                         |                    - |     ​| ​                                                                |+|                           | ddH20                   ​| ​ 6.12                      ​|  ​306                                         |                    - |     ​| ​                                                                |
 |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                | |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                |
 |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ | |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ |
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 ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​||||||| ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​|||||||
 |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           | |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           |
-|                           ​| ​                        ​| ​                           | **Aliquot ​18 µL  to each tube** ​             |                      |     ​| ​                                                                |+|                           ​| ​                        ​| ​                           | **Aliquot ​17 µL  to each tube** ​             |                      |     ​| ​                                                                |
 |                           | 10µM Frd Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 | |                           | 10µM Frd Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 |
 |                           | 10µM Rvs Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 | |                           | 10µM Rvs Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 |
 +|                           | Fusion PCR template ​    ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                     |     ​| ​                                                                |
 |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                | |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                |
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Line 41: Line 55:
   *Run the following program on a thermal cycler ​   *Run the following program on a thermal cycler ​
  
-^ STEP  ^ Action ​  ​^ Time     ^ Memo                                        ^ +^ STEP  ^ Action ​ ^ Time     ^ Memo                                        ^ 
-| 1     | 98˚C     ​| 3 min   ​| Initial denaturation. ​                      | +| 1     | 98˚C    | 3 min    | Initial denaturation. ​                      | 
-| 2     | 98˚C     ​| 10 sec   | Denaturation. ​                              | +| 2     | 98˚C    | 10 sec   | Denaturation. ​                              | 
-| 3     ​| ​˚C  | 30 sec   | Annealing. See Tm table                                  +| 3     ​| ​65 ˚C   ​| 30 sec   | Annealing. See Tm table                     ​
-| 4     | 72˚C     ​| 3 min    | Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ | +| 4     | 72˚C    | 3 min    | Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ | 
-| 5     | GOTO 2   ​| x 29     ​| ​                                            | +| 5     | GOTO 2  | x 29     ​| ​                                            | 
-| 6     | 72˚C     ​| 5:00    | Final extension. ​                           | +| 6     | 72˚C    | 5:00     ​| Final extension. ​                           | 
-| 7     | 4˚C      | FOREVER ​ | Stop reaction. ​                             |+| 7     | 4˚C     ​| FOREVER ​ | Stop reaction. ​                             |
  
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