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interactome:experiments:20191210-2 [2019/12/10 11:44]
dan [Table]
interactome:experiments:20191210-2 [2019/12/10 11:54] (current)
dan
Line 4: Line 4:
  
 == Barcoded cDNA generation with fusion PCR. == == Barcoded cDNA generation with fusion PCR. ==
- 
-#### Material 
-\\ 
 #### Protocol #### Protocol
  
Line 13: Line 10:
 List of paramater tested. List of paramater tested.
  
-|  RT                   |  -       ​| ​ -       |  +        |  +         ​- ​     ​|  ​-      |  +        ​+ ​      +|  RT                   ​| ​ +        |  +       ​  ​Memo  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _                                                           ​
-^ Tm/Target gene        ​| MORF4L1 ​ | MORF4L1  ​^  MORF4L1 ​ ^  ​MORF4L1 ​ | MRFAP1 ​ | MRFAP1 ​ ^  MRFAP1 ​ ^  MRFAP1 ​ ^ +^ Tm/Target gene        ^  MORF4L1 ​ ^  MRFAP1 ​ |   | |   | 
-^  Row/Col on PCR plate  ​1 ​      |  ​2 ​      ^  3        ^  4        ​ ​5 ​     ​ ​6 ​     ^  7       ​^ ​ 8       ^ +^  Row/Col on PCR plate  ​1 ​       ​^ ​ ​2 ​      ​| ​  |                                                              |   
-^  Frd primer ​          ​| ​ PI 11   ​|  PI 11   |  PI 11    ​|  PI 11    ​|  ​PI 13  ​|  ​PI 13  ​|  ​PI 13   |  PI 13   | +^  Frd primer ​          ​| ​ PI 11    |  PI 13   ​|   ​| ​                                                             |   | 
- Rvs Primer ​          |  ​PI 2    ​|  ​PI 2    ​|  ​PI 2     |  ​PI 2     |  ​PI 2   |  PI 2   |  ​PI 2    ​|  ​PI 2    ​| +^  Rvs Primer ​          |  PI 2     |  PI    |   ​| ​                                                             |   | 
-Fusion PCR template ​  |                             ​          ​        ​        ​                  +|                       ​| ​          ​| ​         |   ​| ​                                                             |   | 
-|  ​Tm                                     |  ​56       |  ​56               ​        ​|  ​58      ​|  ​58      ​|+|  ​Row/​Template ​        ​| ​          ​| ​         |   ​| ​                                                             |   | 
 + A                    ​|  ​7-20     |  ​5-20    |   |                                                              ​| ​  | 
 + B                    ​|  ​7-30     |  ​5-30    |   ​| ​                                                             |   | 
 +|  ​C                    ​|  ​7-40     |  ​5-40    |   |                                                              ​| ​  ​
 +|  ​D                    ​|  ​7-50      ​5-50 ​   ​|   ​| ​                                                               ​| 
 + ​E ​                   ​ ​8-20 ​     ​6-20 ​   ​  ​                                                             ​| ​  
 +|  ​F                    ​ ​8-30 ​     ​6-30 ​   |   ​| ​                                                             |   | 
 +|  ​G                    ​|  ​8-40      ​6-40 ​   ​  |                                                              |   | 
 +|  ​H                    ​|  ​8-50     ​| ​ 6-50    |   ​| ​                                                             |   |
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- 
   *Mix the following reagents in one tube (ideally from top to bottom)   *Mix the following reagents in one tube (ideally from top to bottom)
  
 ^  Check                    ^  Reagent ​               ^  Volume (µl)   1 reaction ​ ^  Volume (µl) for 25 reactions with 20µL vol  ^  Final concenration ​      |^ Memo                                                            ^ ^  Check                    ^  Reagent ​               ^  Volume (µl)   1 reaction ​ ^  Volume (µl) for 25 reactions with 20µL vol  ^  Final concenration ​      |^ Memo                                                            ^
-|                           | ddH20                   ​| ​ 6.62                      ​|  ​331                                         |                    - |     ​| ​                                                                |+|                           | ddH20                   ​| ​ 6.12                      ​|  ​306                                         |                    - |     ​| ​                                                                |
 |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                | |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                |
 |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ | |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ |
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 ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​||||||| ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​|||||||
 |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           | |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           |
-|                           ​| ​                        ​| ​                           | **Aliquot ​18 µL  to each tube** ​             |                      |     ​| ​                                                                |+|                           ​| ​                        ​| ​                           | **Aliquot ​17 µL  to each tube** ​             |                      |     ​| ​                                                                |
 |                           | 10µM Frd Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 | |                           | 10µM Frd Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 |
 |                           | 10µM Rvs Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 | |                           | 10µM Rvs Primer ​        ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                 0.5 | µM  |                                                                 |
 +|                           | Fusion PCR template ​    ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                     |     ​| ​                                                                |
 |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                | |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                |
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Line 42: Line 55:
   *Run the following program on a thermal cycler ​   *Run the following program on a thermal cycler ​
  
-^ STEP  ^ Action ​  ​^ Time     ^ Memo                                        ^ +^ STEP  ^ Action ​ ^ Time     ^ Memo                                        ^ 
-| 1     | 98˚C     ​| 3 min   ​| Initial denaturation. ​                      | +| 1     | 98˚C    | 3 min    | Initial denaturation. ​                      | 
-| 2     | 98˚C     ​| 10 sec   | Denaturation. ​                              | +| 2     | 98˚C    | 10 sec   | Denaturation. ​                              | 
-| 3     ​| ​˚C  | 30 sec   | Annealing. See Tm table                                  +| 3     ​| ​65 ˚C   ​| 30 sec   | Annealing. See Tm table                     ​
-| 4     | 72˚C     ​| 3 min    | Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ | +| 4     | 72˚C    | 3 min    | Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ | 
-| 5     | GOTO 2   ​| x 29     ​| ​                                            | +| 5     | GOTO 2  | x 29     ​| ​                                            | 
-| 6     | 72˚C     ​| 5:00    | Final extension. ​                           | +| 6     | 72˚C    | 5:00     ​| Final extension. ​                           | 
-| 7     | 4˚C      | FOREVER ​ | Stop reaction. ​                             |+| 7     | 4˚C     ​| FOREVER ​ | Stop reaction. ​                             |
  
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  • by dan