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dan
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 List of paramater tested. List of paramater tested.
  
-|  RT                   ​| ​ +        |  +       ​| ​  ​| Memo  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _  _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _                                                         ​| ​  | +  ​*10 different barcodes (purified plasmid sample) x 2 barcode types 
-^ Tm/Target gene        ^  ​MORF4L1 ​ ​^ ​ MRFAP1 ​ |   | |   | +  ​*MORF4L1-40bp overlap for all genes 
-^  Row/Col on PCR plate ^  1        ^  ​2 ​      |   ​| ​                                                             |   | +  ​*5 pilot genes with barcodes each. 
- Frd primer ​          |  ​PI 11    |  ​PI 13   ​| ​  ​| ​                                                             |   | + 
-^  Rvs Primer ​          ​|  ​PI 2     ​| ​ PI 2    |   ​| ​                                                             |   | + 
-|                       ​| ​          ​| ​         |   ​| ​                                                             |   | + 
-|  Row/​Template ​        ​| ​          ​| ​         |   ​| ​                                                             |   | +  ​*Frd primer ​: BCamplif-Frd-MORF4L1-v2-4;​PI-34-BClib-reamp-MRFAP1-Frd;​PI-35-BClib-reamp-BCL2L2-Frd;​PI-36-BClib-reamp-BIK-Frd;PI-37-BClib-reamp-MRFAP1L1-Frd 
-|  A                    |  7-20     ​| ​ 5-20    |   ​| ​                                                             |   | +  ​*Rvs primer : PI-33-Barcode-reamp1-Rvs 
-|  B                    |  7-30     ​| ​ 5-30    |   ​| ​                                                             |   | + 
-|  C                    |  7-40     ​| ​ 5-40    |   ​| ​                                                             |   | + 
-|  D                    |  7-50     ​| ​ 5-50    |   ​| ​                                                             |   | + 
-|  E                    |  8-20     ​| ​ 6-20    |   ​| ​                                                             |   | + 
- F                    |  8-30     ​| ​ 6-30    |   ​| ​                                                             |   | + 
-|  G                    |  8-40     ​| ​ 6-40    |   ​| ​                                                             |   | +
-|  H                    |  8-50     ​| ​ 6-50    |   ​| ​                                                             |   |+
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 |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                | |                           | Phusion HF buffer (5x)  |  2.0                       ​| ​ 100                                         ​| ​                   - |     ​| ​                                                                |
 |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ | |                           | 25mM dNTPs              |  0.08                      |  4                                           ​| ​                 0.2 | mM  | Equal volume mix of 100mM dA/T/G/CTPs will give this solution. ​ |
-|                           ​| ​cDNA template ​          |  1                         ​| ​ 50                                          |                      |     | Diluted ​cDNA sample. ​                                           |+|                           ​| ​DNA tempalte (10ng/​µL) ​          |  1                         ​| ​ 50                                          |                      |     | Diluted ​plasmid DNA sample. ​                                           |
 ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​||||||| ^ Transfer the tube on ice                                                                                                                                                                                                 ​|||||||
 |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           | |                           | Phusion pol             ​| ​ 0.2                       ​| ​ 10                                          |                    - |     | Home brew Phusion pol                                           |
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 |                           | Fusion PCR template ​    ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                     |     ​| ​                                                                | |                           | Fusion PCR template ​    ​| ​ 0.5                       ​| ​ 1                                           ​| ​                     |     ​| ​                                                                |
 |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                | |                           ^ Total (µL)              ^  10                        ^  20                                          |                      |     ​| ​                                                                |
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 ^ STEP  ^ Action ​ ^ Time     ^ Memo                                        ^ ^ STEP  ^ Action ​ ^ Time     ^ Memo                                        ^
 | 1     | 98˚C    | 3 min    | Initial denaturation. ​                      | | 1     | 98˚C    | 3 min    | Initial denaturation. ​                      |
-| 2     | 98˚C    | 10 sec   | Denaturation. ​                              |+| 2     | 98˚C    | 30 sec   | Denaturation. ​                              |
 | 3     | 65 ˚C   | 30 sec   | Annealing. See Tm table                     | | 3     | 65 ˚C   | 30 sec   | Annealing. See Tm table                     |
-| 4     | 72˚C    | 3 min    ​| Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ |+| 4     | 72˚C    | 30 sec   | Extension. **15sec/​kbp,​ but using longer** ​ |
 | 5     | GOTO 2  | x 29     ​| ​                                            | | 5     | GOTO 2  | x 29     ​| ​                                            |
 | 6     | 72˚C    | 5:00     | Final extension. ​                           | | 6     | 72˚C    | 5:00     | Final extension. ​                           |
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  • Last modified: 2019/12/20 09:35
  • by dan